限制性核酸内切酶切割的原理：限制性核酸内切酶作用于双链DNA的磷酸二酯键，这种酶能识别特定的碱基序列，并且有特定的切割位点。

不同的限制性内切酶作用方式都不一样。不过大体来说，限制性内切酶都能够特异性识别并结合核酸的特殊反向回文序列（Invertedrepeatpalindromes），然后催化断裂核苷酸链。

限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。