2018.10.11瑞典当地时间中午，北京时间下午5:45，2018年诺贝尔化学奖颁给了三名生物化学专家。

美国科学家弗朗西斯·阿诺德(Frances H.Arnold)获得一半化学奖，以表彰她实现了酶的定向进化；

美国科学家乔治·史密斯(George P.Smith)和英国科学家格雷戈里·温特尔(Gregory P.Winter)分享另一半，以表彰他们实现了多肽和抗体的噬菌体展示技术。

作为酶催化领域，尤其是分子定向进化的先驱，Frances H.Arnold教授名字可谓是如雷贯耳。正是由于她率先在该技术上的突出成就，才造就了生物催化第三次浪潮，使得酶促生物合成进入了全新的时代。

接下来，就让我们一起来了解一下这项诺奖技术——酶分子定向进化。

生物催化剂——酶

在具体介绍这项技术之前，让我们先来了解一些背景知识，以便大家更好地理解。

酶分子定向进化技术是酶催化领域上游核心技术之一。那么，首先我们得清楚什么是“酶”。

我们知道，自然界所有的物质都可以看做是由原子构成的大大小小的分子，小分子包括氧气（O2）和水（H2O），仅由几个原子构成，大分子到由几万、几十万原子（通常用kDa为单位）构成的蛋白质分子。

然而，从一个化学分子到另一种化学分子，伴随着一些化学键的生成和解离，在这个过程中有些可以自发生成，但大多数情况下需要在特定的条件下才能发生。

有一些科学史知识的朋友，一定知道著名的“米勒模拟实验”：即模拟在原始地球还原性大气中进行雷鸣闪电能产生有机物（特别是氨基酸），以论证生命起源的化学进化过程。

所以，在化学合成中，高温、高压是常见的反应条件，因为反应中需要输入足够的能量才能使反应得以进行。为了让化学反应能够更高效地进行，自然界有她独特的方法——催化剂。

一般催化剂，包括酸碱、金属、过渡金属和过氧化物等。但在众多催化剂中，有一种特别突出，那就是酶，它是一种极为高效的特殊催化剂，其化学本质是具有催化活性的蛋白质或核酸。

酶相比较一般催化剂（通常是化学催化剂），其高效的原因就在于它能更大幅度的降低反应活化能，让反应从底物（原料）到产物更容易进行（如上图）。

酶，日本和台湾地区也叫酵素（学术上定义和产业定义不同，这里暂不赘述），是大自然馈赠给我们最好的礼物。可以说，所有生物正是由于酶这种天然生物催化剂才得以生存繁衍。

正是由于酶如此重要的地位，才造就了近20位和酶学研究相关的诺贝尔奖得主，而本次Frances H.Arnold教授的获奖再为酶学领域新添了一枚奖章。

截止今日，根据BRENDA数据库的统计，已经有7511种酶被收录，并赋予EC号码（国际酶学委员会编号）。

酶催化

酶催化，通常我们称生物酶催化，也常被称为“生物催化”。

生物催化（biocatalysis）是指利用酶或者生物有机体（细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程，这种反应过程又称为生物转化（biotransformation）。

这个时候，很多人会把“生物催化”和我们更为熟悉的“发酵”相混淆。甚至有时在专业领域的一些研发人员也会分不清这两个概念。

　　上图很好的诠释了发酵和生物催化的主要区别。

左边即发酵(Fermentation），主要通过活细胞（Growing Cells）实现，不管原料是简单的碳水化合物（De novo fermentation）还是复杂的前体物质（Precursor fermentation）;

右边是生物催化，主要通过死细胞（Dead Cells）实现，不管是全细胞催化（Whole Cells，不进行菌体破碎）还是（游离）酶催化（Cell-free Enzymes，进行菌体破碎并提取酶）。

我们通常将发酵和生物催化统称为“生物合成”（Biosynthesis）。但生物催化不管是全细胞催化，还是（游离）酶催化，都是基于酶催化的本质，所以酶催化和生物催化名称混用的现象很常见。

生物催化，其实并不是新鲜事物，和人工智能一样，它其实也已经经历了三次浪潮。

　　第一次浪潮，大概发生在一个世纪前，科学家发现活体细胞的某些成分可以用于化学转化，但这个时期还停留在实验室阶段，算是生物催化的萌芽阶段。

第二次浪潮，发生在上个世纪八、九十年代，蛋白质工程兴起，扩宽了生物酶的底物范围，使得生物催化的领域拓宽到非天然的医药中间体和精细化工领域。但这个时期还主要处于小试规模，没有形成大规模工业化生产。

第三次浪潮，发生在上个世纪九十年代中后期，也正是这次诺贝尔化学奖之一的Frances H.Arnold教授等发明的酶定向进化技术，极大地改变了生物酶催化剂的蛋白质工程改造效率。

这项技术的出现，伴随着基因合成、测序成本的下降以及计算机辅助的分子模拟技术的发展，使得生物催化技术极大地拓宽了应用价值。这个时期开始，生物催化技术参与的产品工业化规模开始出现。

正是由于酶定向进化技术，才使得酶催化技术极大地提高部分化学药物合成的效率，并顺应绿色化学趋势，创造出了一个又一个举世瞩目的产业神话！所以，本次诺贝尔化学奖颁给这项技术也是众望所归！

部分酶催化药物合成著名产业化案例

酶工程

现在我们知道，酶的本质是具有催化作用的蛋白质或核酸（核酶的发现也是诺奖之一，但囿于篇幅，以下所涉及的酶均指蛋白性质的酶）。

酶作为蛋白质大分子，通常只有在生物体内才能行使高效的催化活性，在生物催化技术发展早期，从生物体内提取的酶通常很不稳定，再加上其生产成本高昂，在相当长时间内仅限于实验室研究，离产业化非常遥远。

为了解决酶本身的诸多问题，科学家们做了相当长时间的努力和探索，我们称之为“酶工程改造”或者“酶工程”。顺便提一下，学术界一般更偏向使用“蛋白质工程”（Protein Engineering），因为方法一样，只是后者涵盖非酶类蛋白质（比如功能性蛋白），覆盖面更广。

从分类来看，我会将酶工程分为狭义的酶工程和广义的酶工程。

狭义的酶工程包括：

理性设计：人工设计（定点突变、从头设计等）

非理性设计：定向进化（随机突变）

半理性设计：人工选定位置或区域内的随机突变

广义的酶工程包括以下三个方面：

酶的分子改造工程：即狭义的酶工程

酶的化学修饰工程：酶固定化、PEG化等

酶的溶剂开发工程：稳定剂、激活剂、抑制剂等添加与配伍等

从上述分类看出，其实酶分子定向进化技术只是酶工程改造中的一个小的分支。但即便如此，由于它独特的优势，已经成为学术界和工业界酶工程改造领域中的通用技术，和其他技术相比其影响不可同日而语。

定向选择与进化

达尔文老先生曾经说过“物竞天择、适者生存”。进化论自清末赫胥黎的《天演论》进入中国，由当时的康有为、梁启超极为推崇后，就在中国广为传播。自此，《物种起源》所阐释的基本理论在历史的长河中虽屡遭冲击，但一直屹立不倒。

达尔文的进化论在阐释物种进化遵循一些前提和假设，而这套理论可以很容易利用下面这张循环图来解释。

当环境发生恶劣变化后，物种繁殖的后代中出现了少数变异，这些变异者比非变异者更适合变化后的恶劣环境，于是它们被环境选择，存活了下来，原来的变异被固化，从而实现了物种的进化。后来，新一轮环境变化发生，变异、选择和进化的循环再次开启。

这个基本模型就是达尔文进化论的核心。

上过高中生物课的朋友也许还有印象。生物体的外在性状主要是由蛋白质体现出来的，而蛋白质的产生遵循“中心法则”，如下图所示。

“中心法则”表明基因决定性状。

但是性状最终是否被表达和留存取决于环境，因为所有的表型都是基因和环境作用的结果，用一个简单公式来表达就是：

P（Phenotype）=G(Gene)x E(Environment)

结果我们之前达尔文的进化论模型，就可知道：

所有的变异都源自基因的变化，所有的进化都是基因适应环境的效应。

复旦大学生态与进化生物学系主任卢宝荣教授曾举过一个斑点蛾（Peppered Moth）的例子，非常契合宏观层面（物种）定向选择和进化的理论。

之前没有被污染的环境下，大部分的斑点蛾都是白色的，黑色的蛾子特别少，因为容易被天敌发现无法生存；但环境被污染后，颜色变深，原先白色的蛾子更容易被天敌捕获，而黑色的蛾子反而生存下来，由此黑色的蛾子数量急剧增加。

正是由于不同环境的选择，斑点蛾的颜色变化频率和数量才发生了巨大的变化，并且进一步的研究表明这正是由于其显色的基因突变所致，这就是所谓的定向选择，进而实现定向进化。这也正是达尔文进化理论的典型证据。

酶分子定向进化

终于到了“酶分子定向进化”技术。有了前面的基础，理解起来就非常容易了。

酶分子的定向进化技术的萌芽可以追溯到上个世纪60年代，由美国分子生物学家Sol Spiegelman利用RNA噬菌体Q第一次在分子水平上定向改造了单一分子开启。

1993年，正是本次诺贝尔化学奖获得者之一的美国科学家Frances H.Arnold首先提出酶分子的定向进化的概念，提出易错PCR（error-prone PCR）方法用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。

这也是为什么参与并建立酶定向进化研究者不少，但诺贝尔奖化学奖在酶分子定向进化技术上仅颁给Arnold教授的原因。

自此，酶分子定向进化技术得到了前所未有的发展和进步。

这里，如果我们把物种的定向选择和定向进化缩小到酶蛋白分子水平，我们就很容易理解这项技术的概念了。

在试管中模拟达尔文进化过程，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质（酶），实现分子水平的模拟进化。

文字不够，我们就上图：

具体来说，首先得在酶蛋白基因水平上尽可能多地人为造成随机突变或重组，形成一个庞大的基因突变库，然后在基因表达出相应的酶蛋白突变体库。

然后，在人工模拟恶劣环境或要求下（比如高温、高毒性）从酶蛋白突变体中定向筛选出具备理想性状的酶蛋白突变体（比如高活性、高选择性、高稳定性等）。

最后，从筛选出的酶蛋白突变体中提取基因，并作为母本，进入下一轮酶基因突变库建立，实现酶的进化。

这就是我们在实验室模拟达尔文进化过程，实现酶蛋白定向进化的基本步骤！

自酶定向进化技术发明以来，至今为止已经衍生出相当多的细分技术，但是无论如何发展，都可以归结为两大方面：基因突变库建立和高通量筛选。

基因突变库的建立方法目前在国内主流的依然是易错PCR（error-prone PCR）。

通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA文库。

为了进一步提高不同策略易错PCR方法的选择，我原先所在的课题组还专门开发了易错PCR策略选择分析工具——MAP。

除了易错PCR方法，基因突变库建立方法层出不穷，还包括：

DNA shuffling

SeSaM

StEP

ITCHY

RACHITT

SCRATCHY

…

其中DNA重排（DNA shuffling）也是使用比较广泛的一项基因突变建库方法。

我博士期间实验组发明的SeSaM(Sequence Saturation Mutagenesis，序列饱和突变），是一种基于序列饱和随机突变的建库方法。

它不仅可以避免常规随机突变偏差，另一方面由于该方法引入了通用碱基，可以对特定序列进行很好的碱基替换控制，是一种更优的建库方法。

然而，建库方法固然重要，但没有合适的高通量筛选的方法也是无济于事。

目前常见的高通量筛选方法包括：

　　Solid phase screening(平板筛选法）

　　Microtiter plate scrreing(微孔板筛选法）

　　Flurorescence-Activate Cell Sorting(FACS法）

三种方法一次性筛选能力（“通量”）各不相同，平板筛选最高为10^4，微孔板筛选最高为10^5，FACS通过流式细胞仪可以超过10^7，但各自都有其优缺点。目前国内最为常用的还是微孔板筛选法。

值得一提的是，本届诺贝尔化学奖颁发给另外两位，以表彰其噬菌体展示技术在多肽和抗体上的应用，其实也可以用于酶突变库高通量筛选，由于篇幅有限，这里不做介绍。

经过20多年的发展，酶分子定向技术成果丰厚，除了之前我提及其在化学药生物催化合成领域巨大的产业化成就外，在方法论领域也是百发齐放，不断进化。

近几年，酶分子定向进化技术已经从原来的1.0时代进入了2.0时代。由于生物信息学的发展，海量关于序列和结构数据被获取，计算机辅助设计和基于结构信息的分析水平进一步提高，从而使得现有的酶分子进化策略越来越采用联合方法实施，并取得了更为明显的效果。

拿KnowVolution为例，可以通过以下4步酶分子改造策略的进一步优化：

传统定向进化：经过数轮建库和筛选，找出潜在有益突变点。

定点饱和突变和筛选：对有益突变点进行饱和突变，发现更多有益取代。

计算机模拟分析：通过3D建模、分子对接和分子模拟等技术，分析有益取代基团特性，提出分子机制，并决定最终氨基酸残基组合的位点。

优势位点组合：将经上述分析优势取代位点进行组合，产生超级突变株。

最后，给大家介绍一下酶定向进化专业实验室。

最左边就是本次获奖的Frances H.Arnold教授，中间这位是德国最著名的酶定向进化专家Reetz教授，该技术的开创者之一。最后一位是Schwaneberg教授，师从Arnold教授，发明了SeSaM方法。感谢他们在该领域做出的贡献，我们相信随着酶定向进化技术获得诺奖，生物催化领域将进一步得到推动，进入人们的视野。