在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用 1 。

在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。

逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。

RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解。