CHO细胞残留DNA检测试剂盒（美版）

HBP003304 100T

产品信息

产品概述

CHO 残留 DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 CHO 宿主细胞DNA残留的试剂盒。本试剂盒利用TaqMan荧光探针原理，定量检测样本中 CHO 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA样本前处理试剂盒（货号：HBP003604）配套使用，可准确定量样品中残留的微量 CHO 细胞DNA。试剂盒配套的 CHO DNA 定量参考品，已溯源至国家标准品。该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。本检测方法可溯源至中国药典方法，通则<3407>。

运输与保存方法

-25℃~-15℃运输；-25℃~-15℃避光保存。

有效期

规定存储条件下 12 个月。

适用机型

本产品适用但不限于以下仪器：7500 Real-Time PCR System (ABI)，QuantStudio 5（ABI），SLAN-96P Real-TimePCR system，qTOWER3G（德国耶拿）

实验所需自备材料

荧光定量 PCR 仪1.5 ml 无菌离心管无菌无酶八联管或 96 孔 qPCR 板1000 μl，200 μl，10 μl 无菌低吸附带滤芯枪头1000 μl，200 μl，10 μl 移液枪

实验流程

1 CHO DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 CHO DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μl、300 pg/μl、30 pg/μl、3 pg/μl、300 fg/μl、30 fg/μl、3 fg/μl。具体操作如下：

1）将试剂盒中的 CHO DNA 定量参考品和 DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心 5 s。

2）取 7 支干净的 1.5 ml 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6。具体稀释方法见 Table 1。

3）CHO DNA定量参考品与DNA稀释液混合后，涡旋混匀 30 s，瞬时离心 10 s。

产品信息

产品概述

全能 核酸酶是 一种来自 于粘质沙 雷氏菌（Serratia marcescens），经基因工程改造的核酸内切酶。能够在非常广泛的条件下（6MUrea，0.1M Guanidine HCl，0.4% TritonX-100，0.1% SDS，1mM EDTA，1mM PMSF）降解双链、单链、线状、环状的 DNA 和 RNA，完全将核酸降解成 3 5 个碱基长度的 5’-单磷酸寡核苷酸。本品经基因工程改造在 Escherichia coli （E.coli）中发酵表达纯化并制备，可应用于科学研究中降低细胞上清和细胞裂解液的粘度，提高蛋白纯化效率；可应用于工业酶催化领域，降低反应液粘度，提高催化效率；还可应用于重组蛋白生产过程中作为宿主残留核酸去除试剂，本品不含 His 标签，可利用金属亲和层析有效去除过程添加的核酸酶，尤其适合 His标签重组蛋白中核酸的去除。

运输与保存方法

≤0°C 运输；-25～-15°C 保存，两年效期（避免冻融）。

单位定义

在 37°C，pH 8.0 条件下，在 30min 内使△A260 的吸收值变化 1.0（相当于完全消化37μg 剪切鲑鱼精 DNA 成为寡核苷酸）所用的酶量定义为一个活性单位（U）。质量控制

• 蛋白酶残留：250KU/mL 的全能核酸酶与底物反应 60min，未检测到活力。

• 细菌内毒素（Endotoxin）：LAL-Test，中国药典 2020 版第四部凝胶限度试验法 通（1143）。

• 微生物负载：中国药典 2020 版第四部无菌检查法 通则（1101），中华人民共和国国家标准，GB 4789.2-2016。

使用条件

• SDS 浓度超过 0.1%，EDTA 浓度超过 1mM时均会明显抑制核酸酶活力。

• 表活Triton X-100，Tween 20和Tween 80浓度不超过 1.5%对核酸酶性质无影响。

产品概述

本试剂盒一个反应能够转录获得 150~200 μg的 RNA 产物，并可放大生产毫克级别的 RNA。转录合成的 RNA 可用于 RNA 结构和功能研究、RNase 保护、探针杂交、anti-sense RNA和 RNAi 等应用。

运输与保存方法

产品概述

本试剂盒一个反应能够转录获得150~200 μg 的 RNA产物，并可放大生产毫克级别的RNA。转录合成的RNA可用于RNA结构和功能研究、RNase保护、探针杂交、anti-sense RNA和RNAi等应用，也可通过牛痘病毒加帽系统（HBP000606）和2’-O-甲基转移酶（HBP000701）加帽，Poly（A） Polymerase（HBP000801）加尾产生mRNA，用于体外翻译、转染等下游应用。

运输与保存方法

产品概述

蛋白酶 K 是一种丝氨酸蛋白酶，具有高效的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所特有的典型催化三联体Asp 39-His 69-Ser 224特征并且活性中心周围有两个 Ca 2+结合位点增加其稳定性，使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。

产品信息:

用途

1. 基因诊断试剂盒；

2.RNA 和 DNA 提取试剂盒；

3.提取组织中非蛋白成份，降解蛋白质类杂质，譬如 DNA 疫苗和肝素的制备；

4.制备脉冲电泳的染色体 DNA；

5.蛋白质印迹；

6.用于体外诊断领域酶法糖化白蛋白试剂的研发和大量生产。

注意事项

使用时戴好防护手套和护目镜，使用后保存良好通风。该产品可能造成皮肤过敏反应。

活性测定方法

酶活定义

单位酶活定义为在规定条件下，每分钟水解酪蛋白生成 1 μmol L-酪氨酸所需的酶量。

试剂准备

试剂 I：底物：1%牛奶乳酪蛋白溶液：1 g 牛奶乳酪蛋白溶于 50 ml 0.1 M 磷酸钠盐溶液，pH 8.0，65-70 ℃水浴孵育 15 min 搅拌溶解，自来水冷却，氢氧化钠调节 pH 8.0，定容 100 ml。试剂 II：TCA 溶液： 0.1 M 三氯乙酸，0.2 M乙酸钠，0.3 M 乙酸(依次称取或量取 1.64g三氯乙酸+1.64g 乙酸钠+1.724ml 乙酸，加入 50ml 纯水中，HCl 调节 pH 4.03，定容100ml）。

试剂 III：0.4 M 碳酸钠溶液（称取 4.24g 无水碳酸钠溶解于 100ml 水中）。

试剂 IV：福林酚试剂：用纯水 5 倍稀释。

试剂 V：酶稀释液：0.1 M 磷酸钠盐溶液，pH 8.0。

试剂 VI：L-酪氨酸标准溶液：0、0.005、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25 umol/ml 的 L-酪氨酸标准溶液，用 0.2 M HCl 溶解。

操作步骤

a 紫外可见分光光度计开机，选择光度测量。

b 参数设置波长为 660nm。

c 打开水浴锅，设置温度为 37℃，用温度计检测温度达到 37℃并维持 3-5min 不变。

d 将 2ml 离心管放置于离心管架上，做好标记，再向离心管中加入 0.5ml 底物，放入 37℃水浴锅预热 10min。

e 吸取 0.5ml 稀释好的酶液加入在水浴锅中预热的离心管中，计时反应 10min。空白组用酶稀释液替代酶液，其它步骤相同。

f 反应时间到，立即加入 1.0 mL TCA 试剂终止反应，加 TCA 的顺序与加酶液顺序相同，间隔时间也一致。拿出离心板架上下颠倒混匀后，放入水浴锅中继续孵育 30min，孵育结束后离心反应液。

g 从离心机中取出反应液，将离心管按离心前的顺序摆放好。在 5ml 离心管架上放上新的离心管，在管盖上做好标记。

h 在新的 5 mL 离心管中按顺序加入如下试剂：

i 将新的加入试剂的离心管颠倒混匀后，放置于 37℃水浴锅中孵育 30min。

j 分光光度计检测样品前用纯水在 660nm 处校零，样品孵育结束后，用紫外分光光度计在660 nm 检测样品吸光度 OD1，调节酶液稀释比例使吸光值保持在 0.13-0.25 的范围内。空白组用酶稀释液替代酶液，其它步骤相同，测定 OD2，则样品实际读数△OD=OD1-OD2。

k L-酪氨酸标准曲线：分别取 0.5 ml 不同浓度的 L-酪氨酸（0、0.005、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25umol/ml）溶液，2.5ml 0.4M 碳酸钠，0.5 ml 福林酚试剂，加入 5mL 离心管中，混匀后 37℃孵育 30 min，测定不同 L-酪氨度为 0uM 的作为空白对照）；根据酪氨酸浓度（Y）和对应的 OD660（X）值绘制 L-酪氨酸对 OD660 的标准曲线 Y=kX+b。

产品信息

产品概述

RNase R（Ribonuclease R）是一种来源于大肠杆菌 RNR 超家族的 3’-5’核糖核酸外切酶，可从 3’-5’方向将 RNA 逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R 可消化几乎所有的线性 RNA 分子，但不易消化环形 RNA、套索结构或 3’突出末端少于 7 个核苷酸的双链 RNA 分子。RNase R 常用于基因表达和可变剪切研究，可消化线性 RNA以使环形 RNA（circRNAs）或套索结构 RNA(lariat RNA)得到富集。RNase R 酶切线性RNA 以富集环状 RNA，用于从 total RNA 中构建内含子 cDNA 文库。

产品组分

运输与保存方法

≤0℃运输；-25~-18℃保存。

产品信息

质量控制

• 纯度(SDS-PAGE)：≥95%.
• E. coli 残留 DNA： RT-qPCR 检测 10 μ L RNase R 的 16S rDNA 基因的 Ct 值≥35。

• 核酸内切酶的活性：在含有至少 10 U RNase R 的 20 μL 反应中，与 1 μg dsRNA 在 37℃下孵育 4 小时，没有检测到降解。

• Dnase 的活性：在含有至少 10 U RNase R 的 10 μL 反应中，与 1 μg pUC19 DNA 在 37℃下孵育 4 小时，没有检测到降解。

• 功能分析：RNase R 在含有 10 U RNase R和 3 μg 293T 细胞的总 RNA 混合物的反应中进行功能测试。RT-qPCR 检测 RNA 丰度。经 RNase R 酶切和不酶切计算，线性 RNA 的 ΔCt 值≥4.5，环形 RNA 的 ΔCt 值≤1。

反应体系和条件

按以上顺序添加反应组分

*RNase R 需要低(0.1-1.0 mM)镁浓度才能发挥活性。底物RNA 溶液中 EDTA 浓度低会对 RNase R 活性产生负面影响。MgCl2 高达 1mm 的终浓度可用于补偿底物中的 EDTA。37℃时活性最佳。

反应时间：37℃孵育 15 min。

反应终止：70°C 加热 10 min。

纯化回收 消化后的 RNA 可使用苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, V:V）溶液(或 Trizol Reagent）抽提，再使用乙 醇沉淀回收；或者使用 RNA纯化柱或磁珠进行纯化回收。

常见问题

1. 消化时间的选择

一般 10-30 min 即可消化掉大部分线性RNA，RT-qPCR 检测线性 RNA 丰度有几百倍的降低，也可按需求适当延长消化时间，但不推荐 1h 以上的消化，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的环状 RNA 被消化。

2. 内参的选择与定量计算

情况 1：RNase R 消化后“直接”进行RT-qPCR 检测对消化组（RNase R+）与对照组（RNase R-）的 circRNA 的进行定量计算时，应统一以对照组（RNaseR-）的β-actin 或 GAPDH 为内参。

情况 2：RNase R 消化后“纯化回收”再进行 RT-qPCR 检测在纯化前加入少量其他物种的 RNA 作为外参，统一以外参标准化样品后再进行计算。

3 . 实验结果一致性（重复性）差

① RNase R 消化/逆转录/PCR 过程中加样不准确；

② RNase R 的用量有偏差；

③ 其他 RNase 污染。

4 . 线性 RNA 未消化

① 反应 体系 中的 NaCl 浓度 过高 抑制 了RNase R 的活性，或存在 RNase R 的失活剂EDTA；

② 某些没有 3’突出末端的结构化线性RNA 或含有 G-四联体的线性 RNA 可能耐受RNase R 消化。

5 . 环状 RNA 也被消化

①外源 RNase 污染，使用 RNase-Free 耗材，反应体系可适当加入 RNase 抑制剂；

②少数环状 RNA 耐受 RNase R 消化力弱的，可尝试减少 RNase R 用量或缩短消化时间。

规格

预期用途

本试剂盒利用 TaqMan 荧光探针的 qPCR 检测原理对重组蛋白、抗体、疫苗等生物制品中 E.coli 细胞残留 DNA 进行定量测定，检测快 速，专一性强。仅供研究使用，不可用于临床。本检测方法可溯源至中国药典方法，通则<3407>。

试剂盒组成

储存条件及有效期

1. 有效期：规定储存条件下 24 个月。
2. 运 输 和 储 存 ： 长 时 间 储 存 请 放 置 在 -25~-15℃ ，运输过程中请放置在干冰或冰 袋中。

E.coli DNA 阳性对照标准曲线样品的 制备

E.coli DNA 阳性对照品浓度标注于管壁标签上，确认实际浓度后再进行稀释。用试剂盒中提供的DNA稀释液将CHO DNA阳性对照品进行梯度稀释，稀释浓度依次为3000pg/μL、300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、0.3pg/μL、0.03pg/μL、0.003pg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的 E.coli DNA 阳性对照品和DNA 稀释液从-20℃取出后置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，快速离心 2~5秒。

2. 取 7 支低吸附离心管，分别标记为 ST0、ST1、ST2、ST3、ST4、ST5 和 ST6。按下表准备 E.coli DNA标准样品，每步稀释后各管均用旋涡混合器混匀，快速离心 2~5 秒，再进行下一个梯度稀释，标准样品稀释完后2~8℃保存，现配现用。

E.coli DNA 阳性对照品的稀释

已融化未使用的 DNA 稀释液可暂存于 2-8℃

加样回收质控 ERC 的制备

根据需要设置 ERC 中的 E.coli DNA加标量 （建议加标量设定为其样品历史无加标测试值的 2~30 倍），以制备加 30pg CHO DNA量的供试品 ERC 为例，

具体操作如下：

1. 取100μL供试品加入1.5mL低吸附离心管中。

2. 加入 10μL ST3，混匀，标记为供试品 ERC。
3. 样本 ERC 与同批供试品一起进行前处理，制备成供试品 ERC 纯化液。

阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，

具体操作如下：

1. 取 100μL 供试品基质溶液（或 DNA 稀释液）加入 1.5mL 低吸附离心管中标记为阴性质控 NCS。阴性质控 NCS 和同批供试品一起进行前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

qPCR 反应体系

1.根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数。反应孔数=（6 个浓度梯度的标准曲线样品

+1 个空白对照 BLK+1 个阴性质控 NCS+供试品+供试品 ERC）×3；

2.根据反应孔数计算本次所需的反应混合液的总量：反应混合液总量=（反应孔数+2）×（15μL qPCR Master Mix + 5μL Compound of primers and probes）（含有 2 孔的加样误

差损失量）

3.各试剂置于室温融化后，根据上一步所计算的引物与 Mix 的量配置所需要的反应混合液，轻微振荡混匀，然后按下表所示加样

产品概述：

运输与保存方法