氧化型辅酶是将０．１－５０ｍＭ　　ＭｇＣｌ↓［２］、５－２００ｍＭ　　ｐＨ为６．５－８．５的磷酸盐缓冲液、０．１－５％氧化型辅酶Ｉ衍生物、０．０３－２％苹果酸或苹果酸盐、１００－５０００Ｕ苹果酸脱氢酶进行酶催化反应，减压，于还原型辅酶Ｉ衍生物的最大吸收峰处测定吸光值，至吸光值不在增加，反应结束；调节ｐＨ至８．５－１０．５，超滤分离苹果酸脱氢酶并终止反应；滤液真空浓缩，在浓缩液中加入７－１３倍浓缩液体积的乙醇，静止，离心，分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤２－４次脱水，真空干燥即可。本发明专利技术中的辅酶Ｉ及其衍生物原料在中性反应条件下性质较为稳定，反应时间可以大大延长。时间延长可以降低酶和苹果酸盐的用量，使分离纯化工艺简化；同时辅酶Ｉ及其衍生物在反应时的分解也会降低，使产品质量提高。