根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeⅡ）及第三型（TypeⅢ）。

第一型限制酶:同时具有修饰（modification）及识别切割（restriction）的作用；另有识别（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位（cleavagesite）距离识别位（recognitionsite）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶:只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindromesequence）；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。

第三型限制酶:与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。