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技术指标
外观:白色或微黄色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥150 U/mg 酶粉;过氧化氢酶:≤0.1%;蛋白酶:≤0.001%;肌酸酶:≤0.001%;ATP 酶:≤0.001%;
酶学性质
来源:微生物;分类:EC 3.5.2.10;分子量:29 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.3;Km值:5.0×10-2 M(Creatinine),8.0×10-2 M(Creatine);抑制剂:Hg2+,Cu2+,Fe3+;最适pH:7.0-8.0;最适温度:65℃;pH稳定性:pH 5.5-10.0(25℃,16 h);热稳定性:65℃ 以下稳定(pH 8.0,30 min);稳定性:-25~-15℃ 静置保存 12 个月保持 90% 以上活性;保护剂:糖类以及 BSA。
用途:水解肌酐,用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。
活性测定方法
原理:Creatinine+H2O Creatinine amidohydrolase Creatine
酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化反应生成 1μmol 肌酸所需的酶量。
试剂准备
试剂I:0.3 M 磷酸钾缓冲液,pH 6.5。
试剂II:0.1 M 肌酐溶液(1.13 g 肌酐溶于 100mL UP 水中)。
试剂III:4%Na2CO3 溶液(4.0 g Na2CO3 溶于100mL UP 水中)。
试剂IV:2%α-萘酚溶液(2.0 gα- 萘酚溶于100 mL 99.5% 乙醇中)。
试剂V:1.2 g NaOH 和 3.2 g Na2CO3 溶于双蒸水中,定容至 100 mL。
试剂VI:0.05% 二乙酰溶液(0.05 mL 二乙酰加水定容至 100 mL)。
酶稀释液:5 mM Tris-HCl pH 8.0
操作步骤
1. 在5 mL 离心管中加入0.1 mL试剂I,0.8mL 试剂 II。
2. 37℃ 水浴 5 min。
3. 加入 0.1 mL 待测样品,37℃ 孵育 10 min。
4. 加入 2.0 mL 试剂 III 终止反应,取出置于冰上。
5. 在新的 5 mL 离心管中按顺序加入如下试剂:第 4 步的溶液 80μL;双蒸水 720μL;试剂 IV 400μL;试剂V 400μL;试剂VI 400μL
6. 25℃静置1 h后,加入2 mL 双蒸水稀释。
7. 用分光光度计在 525 nm 检测吸光度。
*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb
活力计算
Vt:反应液总体积(1.0 mL);
Vs:酶液体积(0.1 mL);
t:反应时间(10 min);
df:稀释倍数;
C:酶浓度(mg/mL);
1.0:光路长度(cm);
0.0704:标准反应条件下,生色基团在 525nm 处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。
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